Nat Commun | 陈忠团队揭示下托参与颞叶癫痫发病的环路及分子机制

撰文︱费  凡

责编︱王思珍

编辑︱杨彬薇

癫痫是神经系统最常见的疾病之一，困扰了全球近1%的人口，并有近1/3的患者症状难以被抗癫痫药物控制[1]。药物难治率在以海马、杏仁核等区域起源的颞叶癫痫（Temporal lobe epilepsy，TLE）中甚至可达70%以上[2]。绝大部分颞叶癫痫病人还会伴随具有高致残、致死率的继发性全面发作（secondary generalized seizure，sGS），造成了严重的社会负担，因此亟需研究颞叶癫痫的发病机制并寻找新的治疗策略及药物治疗靶点。近年来，越来越多的观点认为癫痫发作是关键脑区的功能异常导致神经环路水平上“兴奋-抑制”失衡的结果，调控关键脑区及相关环路在癫痫治疗中尤为重要[3, 4]。

2022年8月25日，浙江大学/浙江中医药大学陈忠团队在Nature Communications杂志在线发表了题为“Discrete Subicular Circuits Control Generalization of Hippocampal Seizures”的研究论文。首次揭示了海马下托的兴奋性谷氨酸能神经元在颞叶癫痫中的异质性作用，其中下托投射到丘脑前核的神经环路中超极化激活的阳离子门控通道（HCN）介导的的簇状放电密切增强了颞叶癫痫的形成和泛化。（拓展阅读：陈忠课题组最新进展，详见“逻辑神经科学”报道（点击阅读）：Current Biology︱陈忠团队在组胺调控摄食机制方面取得新成果：H2受体依赖的内侧隔核组胺能回路；Sci Adv︱陈忠团队提出癫痫药物治疗新思路：电响应型聚多巴胺纳米递药系统；Research︱陈忠团队揭示外侧下丘脑CaMKIIα+神经元调控捕食行为的环路机制）

海马是颞叶癫痫最常见的灶点，下托作为海马信号的主要输出门户，在癫痫临床和基础研究中受到了广泛关注。在难治性颞叶癫痫病人的脑片中，仅在下托出现了1 Hz左右的发作间期同步化放电，提示其可能是癫痫起始和传播重要的特殊结构[5, 6]。同时，发作前下托神经元的高度同步化放电往往对于癫痫自发至关重要[7]。陈忠教授实验室长期关注这一关键脑区在癫痫中的作用。前期研究发现低频电刺激下托在不同颞叶癫痫动物模型中具有非常好的抗癫痫作用，提示其在颞叶癫痫中是一个有效的干预靶点[8]。进一步，课题组的前期研究结果提示异常去极化的GABA能信号[9]和过度兴奋的谷氨酸能信号[10-12]协同参与了颞叶癫痫的发作及耐药的产生。本研究在下托“门控”癫痫理论的基础上，进一步探究下托的兴奋性谷氨酸能神经元在颞叶癫痫中的神经环路机制及调控的分子靶点。

图1 下托谷氨酸能神经元介导颞叶癫痫发作

（图源：Fei F, et al., Nat Commun, 2022）

首先，研究者们利用经典的小鼠海马电点燃TLE模型[13]发现，下托的谷氨酸能神经元在颞叶癫痫发作中被高度激活，且激活的神经元主要集中在下托的深层。用光遗传学整体地调控下托的谷氨酸能神经元，在TLE的形成过程和继发性全面发作两个阶段均可以双向调控发作的严重程度（图1）。

接着，研究者们在神经环路追踪实验中，发现下托的谷氨酸能神经元向大量脑区进行了广泛的投射。在这些下游脑区中，NAc、ANT、MMB、EC等核团在癫痫全面性发作（sGS）后被高度激活。尤其是ANT，在癫痫发作的早期阶段即产生大量神经元激活，提示这些核团参与TLE发作的可能性。

图2 下托-丘脑前核的谷氨酸能神经环路双向调控颞叶癫痫发作

（图源：Fei F, et al., Nat Commun, 2022）

研究者们接着调控了下托-ANT的谷氨酸能投射环路，发现光遗传激活这条环路能显著促进癫痫的形成过程和sGS，这种效果甚至强于调控整体的下托谷氨酸能神经元。反之，光遗传学抑制下托-ANT的投射环路则显著抑制了癫痫的形成过程和sGS（图2）。上述的结果说明，下托-ANT的谷氨酸能神经环路在TLE的sGS中起双向调控的作用。同时，研究者们也关注了其他三条谷氨酸能神经环路，下托-EC，下托-NAc和下托-MMB对癫痫的调控作用，发现当下托-EC环路被抑制时，癫痫的形成过程相比对照组反而加快。此外，当小鼠被完全点燃后，抑制EC投射的下托谷氨酸能神经元末梢轻微地延长了癫痫发作时的ADD和GSD。相比之下，抑制NAc和MMB投射的下托谷氨酸能神经元末梢对癫痫发作没有明显影响（图3）。这些结果提示下托投射到下游不同脑区的神经环路对于TLE发作的调控具有异质性。

图3 下托-内嗅皮层、下托-乳头体、下托-伏隔核谷氨酸能神经环路在颞叶癫痫中作用不同

（图源：Fei F, et al., Nat Commun, 2022）

在KA诱导的慢性癫痫模型[14]中，研究者们结合化学遗传学长时程抑制下托-ANT和 -EC的环路，同样发现在ANT局部给予CNO减少了癫痫发作的次数和总时间；当CNO局部注射到EC时，小鼠的发作次数和总发作时间均增加（图4）。这些结果表明，下托的谷氨酸能神经元通过不同的下游环路对癫痫发作进行差异性调节，其中下托-ANT和下托-EC两条环路对癫痫发作的作用相反。

图4 下托-丘脑前核、下托-内嗅皮层谷氨酸能神经环路在KA诱导的慢性癫痫中作用相反

（图源：Fei F, et al., Nat Commun, 2022）

那么是什么导致了下托谷氨酸能神经元的差异性作用呢？极有可能是下托支配不同下游脑区的谷氨酸能神经元存在解剖学上的分群，并且传递不同的癫痫信号。为了验证这种猜想，研究者们首先在不同的下游脑区注射了携带不同荧光的逆向标记病毒，进行追踪。结果显示，ANT投射的神经元几乎完全位于下托深部（即癫痫后主要激活的下托区域），而EC投射的神经元主要分布在下托的浅表层，两者完全分离。接下来，研究者们利用Axon-GCaMP6s病毒，进一步检测TLE发作时下托-ANT和下托-EC环路水平上钙信号发放的变化。结果显示，在癫痫发作早期，ANT末梢的钙信号增加，而EC则相应减少；当到达sGS期时，ANT末梢的钙信号强度随着癫痫发作的发展而延迟增加，并伴随着癫痫的终止回到基础状态；而在EC末梢，在癫痫发作后，钙信号下降（短暂一过性的升高）至低于基础状态水平（图5）。这些结果表明，这两个亚群的下托谷氨酸能神经元对TLE的功能反应是独立且相反的，其中，ANT投射的神经元正向高度响应癫痫发作，而EC投射的神经元在癫痫中的活动反而被抑制。

图5 丘脑前核和内嗅皮层投射的下托神经元亚群在颞叶癫痫中响应模式不同

（图源：Fei F, et al., Nat Commun, 2022）

研究者们后续对ANT投射的深层下托神经元和EC投射的浅层下托神经元进行了在体多通道记录，发现深层的下托谷氨酸能神经元具有更强的簇状放电能力（图6a-d）。进一步的离体电生理显示，ANT投射的下托谷氨酸能神经元，尤其是簇状放电的神经元胞体上存在着较大的超极化激活的内向电流，提示其超极化激活的环核苷酸门控阳离子（HCN）通道的功能可能更强，并表现出更强的簇状放电能力。孵育HCN通道拮抗剂后可以一定程度上减弱这种簇状放电能力（图6e-m），提示HCN通道的功能可能促进了ANT投射的下托谷氨酸能神经元的簇状放电能力。

图6 丘脑前核投射的下托神经元亚群存在HCN通道促进的簇状放电能力

（图源：Fei F, et al., Nat Commun, 2022）

研究者们最后在下托直接给予拮抗剂和通过shRNA来特异性地敲降ANT投射的下托谷神经元上的HCN通道，发现对癫痫发作均有显著的抑制作用。进一步，由于簇状放电对于神经环路可塑性的增强具有重要作用，最后，研究者利用在体单脉冲测试环路可塑性的实验，发现在癫痫形成过程中在下托HCN拮抗剂或光遗传学抑制下托-ANT环路均显著减弱了由下托传出的电信号在ANT中记录到的强度（图7），提示HCN通道参与的神经元簇状放电在颞叶癫痫泛化过程中的兴奋性环路增强的作用，提示下托-ANT神经环路中的HCN通道是颞叶癫痫的重要干预靶点。

图7 下托-丘脑前核环路中HCN通道参与的突触可塑性加速颞叶癫痫的形成和泛化

（图源：Fei F, et al., Nat Commun, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望

本研究首次发现下托不同亚区的神经元通过不同的投射下游对颞叶癫痫中的“兴奋-抑制”平衡调控产生差异化（甚至相反）的作用。其中下托投射到丘脑前核的神经环路中超极化激活的阳离子门控通道（HCN）介导的簇状放电密切增强了颞叶癫痫的形成和泛化，提示其在颞叶癫痫中精准干预的重要性，同时也是对下托门控颞叶癫痫发病机制的重要补充。然而，下托的簇状发放神经在癫痫前后的数量及功能变化，目前仍不得而知。如何用更精准的方法特异地调控ANT投射的下托谷氨酸能神经元，也是未来研究的一项挑战。此外，下托的谷氨酸与GABA能神经元还受到上游大量的神经输入，本研究揭示的异质性下托神经环路中接受的上游兴奋/抑制性输入是否存在差异，以及如何参与了颞叶癫痫的调控，需要进一步探索。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-022-32742-x

该研究的第一作者为浙江大学药学院的博士研究生费凡（现在为浙江中医药大学博士后），硕士研究生王霞及浙江中医药大学的徐层林研究员，陈忠教授、汪仪研究员和徐层林研究员为本文的通讯作者。研究受到了国家自然科学基金重点项目、国家自然科学基金优青项目、浙江省自然科学基金重大项目等的资助。

第一作者：费凡（第三排左数第十位）王霞（第三排左数第十三位）徐层林研究员（第二排左数第六位）；通讯作者：陈忠教授（第二排左数第四位）、汪仪研究员（第二排左数第五位）和徐层林研究员

（照片来源：陈忠教授实验室）

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参考文献（上下滑动阅读） 

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本文完